眼咽型肌营养不良(oculophargngealmusculardystrophy,OPMD)是一种常染色体显性遗传性疾病，多在40岁左右起病，首先出现对称性眼外肌无力或/和眼睑下垂，后逐渐表现吞咽、构音困难，进展十分缓慢。少数患者以吞咽障碍为首发症状。也有些患者伴有轻度的面肌、咬肌、颞肌以及肢带肌等的无力和萎缩。该疾病目前尚无治愈或减缓疾病发展的疗法，仅能通过物理治疗等手段帮助病人缓解症状及改善生活质量。因此，研究发展新型治疗手段十分必要。

OPMD病人在PABPN1的第一个外显子区域发生突变，正常人中具有10个重复的丙氨酸编码序列GCN在病人中增加到11-18个重复。突变的PABPN1蛋白可导致错误折叠，在细胞核中形成不溶性的颗粒。但PABPN1突变导致OPMD的分子机制还不清楚。这篇文章的作者们尝试使用一种双重基因疗法治疗OPMD。他们在使用RNAi降低内源性PABPN1表达的同时，表达一种经过序列优化的抵抗RNAi干扰的PABPN1。这种治疗手段在小鼠模型上取得了较好的效果。

研究者们开发了一种针对OPMD的双重基因疗法，在小鼠模型上验证治疗效果。

1.PABPN1的敲低和置换。为了敲低OPMD小鼠模型中内源性的PABPN1研究者们设计了三条shRNA序列，分别连接在U61、U69和H1启动子下游，构成顺式组合质粒shRNA3X（图1）。该质粒转染HEKT细胞后，可有效降低PABPN1蛋白水平。此外，在PABPN1敲低的HEKT细胞中重新引入经过序列优化、不受shRNA降解的optPABPN1后，PABPN1蛋白水平得到回补。但引入序列扩增的突变型expPABPN1不能回补PABPN1蛋白水平（图1）。

图1.PABPN1在HEKT细胞中的敲低和置换。

随后，研究者们将PABPN1敲低和置换的载体引入OPMD小鼠模型，得到了类似的结果。PABPN1的shRNA3X载体有效的降低了内源性PABPN1蛋白水平，包括正常和序列扩增的突变型PABPN1，而重新引入的optPABPN1使得正常PABPN1水平得到了有效回补（图2）。

图2.PABPN1在OPMD小鼠模型中的敲低和置换。

2.基因疗法对OPMD小鼠肌肉组织的表型改善。

研究者们在小鼠模型中的研究发现，单纯敲低PABPN1会引起小鼠肌肉组织损伤，表现为显著的肌肉退化和再生（图3）。这些症状在同时引入optPABPN1的小鼠中不会出现（图3）。因此，正常的PABPN1表达对于调控小鼠肌肉退化和再生有着重要功能。

图3.单纯敲低PABPN1对小鼠肌肉的损伤。

在OPMD小鼠模型中同时引入shRNA3X和optPABPN1后检测各项肌肉指数，包括collagenI、III、IV、fribronectin表达量、肌纤维横截面积、肌肉质量、绝对肌力等指标，发现均有明显改善（图4）。

图4.同时引入shRNA3X和optPABPN1可改善肌肉纤维化和肌纤维萎缩等症状。

3.基因疗法对OPMD小鼠肌肉转录组的影响。。研究者们利用RNA芯片检测了接受基因疗法前后OPMD小鼠的转录组变化情况。OPMD小鼠肌肉转录组与野生型小鼠相比有显著差异，研究者们发现这些差异在接受基因疗法后有减缓或消失的趋势（图5）。PCA分析显示，同时引入shRNA3X和optPABPN1的OPMD小鼠，其转录组数据更加接近野生型小鼠，而与OPMD小鼠差别较大。在OPMD小鼠肌肉中表达量升高或下降的基因，在引入shRNA3X和optPABPN1后表达量有明显的回复到正常表达水平的趋势。

图5.OPMD小鼠转录组。

4.基因疗法在OPMD病人中应用的可行性研究。在小鼠模型中的实验获得预期结果之后，研究者们使用同样的策略处理从OPMD病人体内分离培养的肌肉细胞样本，获得了类似的结果（图6）。在病人肌肉细胞中引入shRNA3X和optPABPN1之后，细胞存活率明显上升。因此，这种结合了内源PABPN1敲低和外源正常PABPN1引入的基因疗法，可能带来OPMD治疗的新方法。

图6.shRNA3X和optPABPN1抑制OPMD病人肌肉细胞凋亡。

参考文献：1.Malerba,A.etal.PABPN1genetherapyrescuesdiseasephenotypeinoculopharyngealmusculardystrophy.Nat.Commun.8,1–14().

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